酵母双杂交实验有哪些注意事项?

来源：学生作业帮助网编辑：作业帮时间：2024/05/03 20:08:16

酵母双杂交实验有哪些注意事项?
酵母双杂交实验有哪些注意事项?

酵母双杂交实验有哪些注意事项?
如果诱饵蛋白对酵母细胞是有毒的,该怎么办?
在某些情况下,在液体培养基中培养不好的菌珠可以在固体培养基上生长得很好.首先重悬克隆于1ml的SD/–Trp,接着将重悬液平铺于5 个100-mm的SD/–Trp平板,在30℃下温浴,直至平板上的克隆相互粘在一起.用5ml 0.5X YPDA刮下每块板上的克隆,并收集到一管中,这样就可以使用这个细胞重悬液进行正常的杂交反应.
2.如果诱饵蛋白能直接激活报告基因的表达,该如何处理?
该蛋白很可能有转录激活域,是个转录因子.可以通过基因重组切掉转录激活域,然后重新检测其是否自激活,但要注意重组也有可能破坏蛋白之间的互作.
3.转化效率太低怎么办?
可以采用以下方法解决：
1) 检测一下DNA的纯度,如果可以的话,重新用乙醇纯化.
2) DNA-BD/诱饵蛋白很可能是有毒的.
3) 不适当的培养基,重新配制培养基,并做对照转化.
4) 检测pGBT9对照载体的转化效率,放置于SD/–Trp平板上,转化效率应该在1 x 105 colonies/mg DNA以上.
4.杂交效率不高,该如何处理?
在杂交中,预转化的诱饵细胞的数量可能不够.当对诱饵菌株进行液体培养过夜时,应挑选大的、新鲜的克隆进行培养,经过离心和重悬后,再使用血球计对细胞进行计数.密度应该在1 x 109/ml.
一个甚至两个融合蛋白对酵母细胞有毒.你可以通过重组方法来减轻毒性,同时又能保证蛋白的相互作用.或者使用表达水平较低的载体.也可以在琼脂平板或滤膜上进行杂交.但同时必须作杂交对照实验.

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